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更新時間：2025-11-06
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| 問01: | 實驗中遇到TOP-10轉化后無法長出菌落 |
| 答01: | 1、檢測下感受態(tài)是否有問題：在不含有抗性的平板上做個空白驗證；2、是否轉化成功？可以用別的質粒試一下；3、42℃熱激45s或是60s試一下 |
| 問02: | 高濃度時沒有抗性作用，和預期的結果不相符。以前用的是上海生工的潮霉素，相同濃度值沒有效果！ |
| 答02: | 不同廠家的抗生素效價有區(qū)別，我們用大腸桿菌做抑菌實驗檢測150ug/ml可以抑菌，低濃度沒有抑菌效果。真菌的用量需要比細菌濃度高一些。（對于植物細胞，其有效濃度是20–200μg/ml；對于細菌，有效濃度是20–200μg/ml；對于真菌，有效濃度是200μg–1 mg/ml）。建議您增加一下用量。 |
| 問03: | C1100 DH5α感受態(tài)細胞 我們連接產物做轉化涂板后不長斑，三個人做了不同的轉化都是一樣的結果 |
| 答03: | 1、確認下連接條件是否合適，要注意連接產物搖菌時不可以加含有抗生素的培養(yǎng)基；2、用質粒轉化試一下是否也不長菌或是做個空白對照。 |
| 問04: | 你們公司幾種感受態(tài)的區(qū)別？ |
| 答04: | 1、C1100 DH5菌株：克隆菌，用于分子克隆、質粒提取?？捎糜谒{白斑篩選。 2、C1200 TOP-10菌株：克隆菌，用于分子克隆，質粒提取?？捎糜谒{白斑篩選。該菌株適用于高效的DNA克隆和質粒擴增，能保證高拷貝質粒的穩(wěn)定遺傳。 3、C1300 JM109菌株：克隆菌，用于分子克隆。一種支持帶有琥珀突變的載體生長的重組缺陷的抑制型菌株，對轉染的DNA有修飾作用而無限制作用。 4、C1400 BL21(DE3)菌株：表達菌，可用于表達非毒性蛋白。該菌株用于高效表達克隆于含有T7噬菌體啟動子的表達載體的基因。適合非毒性蛋白的表達。 5、C1500 BL21(DE3)pLysS菌株：表達菌，可表達毒性蛋白和非毒性蛋白。pLysS菌株含有pLysS質粒，因此具有氯霉素抗性。pLysS質粒含有表達T7溶菌酶的基因，能夠降低目的基因的背景表達水平，但不干擾目的蛋白的表達。適合毒性蛋白和非毒性蛋白的表達。 |
| 問05: | 藍白斑篩選，選的是藍色的菌落還是白色的？ |
| 答05: | 在含有X-gal和IPTG的篩選培養(yǎng)基上，攜帶載體DNA的轉化子為藍色菌落，而攜帶插入片段的重組質粒轉化子為白色菌落，平板如在37℃培養(yǎng)后放于冰箱3-4小時可使顯色反應充分，藍色菌落明顯。 |
| 問06: | 常用抗生素推薦使用濃度？ |
| 答06: | 氨芐青霉素(Amp)：100ug/mL（細菌）；卡那霉素(kan)：10-50ug/mL（細菌）； 鏈霉素(str)：10-100ug/mL；利福平（Rif）：50-100ug/mL；慶大霉素：10-50ug/mL；兩性霉素：0.25ug/mL |
| 問07: | 連接轉化效率低？ |
| 答07: | 1、連接體系不合適；2、平末端不易連接，4°過夜，動作一定要輕柔；3、縮短熱激時間，改為45s；4、檢測酶是否合適（pfu擴增需單獨加ployA尾巴） |
| 問08: | 轉化后長出雜菌？ |
| 答08: | 如果是單菌落周圍長出來衛(wèi)星菌落，說明培養(yǎng)時間過長，菌株老化了，對后續(xù)實驗影響不大，活化一下就好；如果是大小差不多的菌落，說明操作過程中污染了 |
| 問09: | 轉化后只長出幾個菌落？ |
| 答09: | 1、若果是轉化的連接產物或是突變產物正常；若是質粒，則注意下是否操作有問題；2、有些質粒的確轉化率低，可以換一種感受態(tài)試一下 |
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